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科研宝典:各类病毒在科研中的使用技巧(值得

发布时间:2019-08-13浏览次数:文章来源:艾科赛斯生物科技

  对于科研工作者来说,由于动物实验更能模拟人类的生理和病理条件,所以比体外实验更有说服力。

  在某个通路或某种疾病的研究中,通常会人为地将外源基因用病毒载体注入动物组织,检测其对其他基因和通路、组织器官、动物行为等的影响。但这类动物实验条件的摸索和优化,是一个难点。

  选择何种病毒、如何选择注射的部位、注射多少体积、以及注射后的检测时间等实验条件都需要摸索。

病毒产品该如何选择?

载体种类

外源基因表达时间

慢病毒

2-4天开始表达, 长时间稳定表达

腺病毒

1-2天开始表达,持续7-14天

腺相关病毒(AAV)

7-14天开始表达,

细胞分裂不旺盛部位可长时间表达

  此时您可以根据研究目的,选择适合的产品。

  一般需要进行体内动物实验的推荐使用慢病毒和腺相关病毒AAV。

  慢病毒因其转染效率高、感染谱广、适合体内体外实验等突出优势,广泛应用于基因功能研究,尤其是在肿瘤研究领域。

  腺相关病毒(AAV)体积最小,因此载体的容量最小,具有无致病性,扩散效果好,病毒滴度高,且能在转染的宿主细胞中长期表达等优势。AAV注射动物后,一般会在1-2周左右开始表达,体内实验一般建议感染后3-4周看第一批结果。在AAV中有一类组织特异性AAV载体由于其“高效感染  靶向调控”实现在不同组织中特异性的高效表达受到了诸多科研工作者的青睐。

  如何提高病毒的在体实验感染效率?

  查询相关的文献,参考文献中病毒用量、注射方法、注射位点等详细信息,再摸索一下实验条件,改变一下病毒的注射方法和用量等。很多情况下,感染效率不好并不是病毒本身的原因,而是由于实验操作步骤、注射位点、或者注射方法的问题导致的。经过一段时间的实验条件摸索,可以得到相对更好的结果。

  在此给大家分享一些工具病毒在不同系统中的注射剂量参考,相关参数来源于已发表的文章,在体实验应用较多的是慢病毒和腺相关病毒AAV,并且最广泛的应用于神经系统、心血管系统和肝脏等研究领域。 

神经系统 

病毒类型

注射部位

病毒滴度

注射方法

检测时间

慢病毒

小鼠右侧皮层

2+E9TU/mL

每侧3 位点,0.7μL/ 位点,速度0.2μL/min,留针10min

5 天

大鼠下橄榄体

1+E8TU/mL

1+E9TU/mL

 

1μL/ 位点,速度0.2μL/min,留针5min

21天

大鼠丘脑

4+E9TU/mL

4 个位点,3μL/位点

14天

小鼠海马齿状回

2+E7TU/mL

5+E8TU/mL

 

2μL/点. 0.5μL/min,留针5min

14天

大鼠海马CA1区

1.5+E9TU/mL

体积5μL,速度0.3μL/min

14天

大鼠鞘内注射

1+E9TU/mL

 

28天

大鼠坐骨神经

1.8+E9TU/mL

2μL,速度0.4μL/min,

留针2min。左侧

注射干扰慢病毒,右侧注射对照慢病毒。

 

28天

腺病毒

小鼠右脑室

1.3+E10PFU/mL

3μL,速度0.2μL/min

8,10,14天

大鼠鞘内注射

1+E10PFU/mL

 

3天

AAV

小鼠大脑皮层

0.5-5+E13vg/mL

1.5μL / 位点,按照核团的坐标一侧皮层注射3 个位点

4周

小鼠双侧皮层

1.49+E12v.g/mL

0.5μL/ 位点,速度30nL/min,留针10min

至少28天

小鼠双侧海马

 

1μL/ 位点,速度0.2μL/min,留针10min

14天

小鼠双侧松果体

1+E12v.g/mL

0.8-1μL/位点,速度100-150nL/min,保留5min

 

小鼠脊髓注射

1+E12v.g/mL

8个位点, 1μL/位点

30天


心血管系统 

病毒类型

注射部位

病毒滴度

注射方法

检测时间

慢病毒

小鼠尾静脉注射

感染主动脉

 

 

100μL,7.6+E7IFUs/ 小鼠

28 天

腺病毒

小鼠心肌

1+E9PFU/mL

5个位点,总体积20μL

7,14,28 天

AAV

小鼠尾静脉注射

感染心肌

3.15+E9,1+E10

3.15+E10,1+E11

v.g/mouse

不同的病毒剂量注射

将这些病毒量的病毒稀释20μL,

尾静脉注射

4 周

小鼠左心室顶端

3+E11v.g/mL

1.5+E9 的病毒量,稀释到50μL

2,4,8 周


肝 脏 
 

病毒类型

注射部位

病毒滴度

注射方法

检测时间

慢病毒

小鼠尾静脉注射

 

5+E7IU/ 小鼠

 

大鼠肝门静脉注射

3+E8TU

100μL,3+E8TU 每4 天注射一次共3 次

26 天

腺病毒

小鼠尾静脉注射

感染肝

 

1+E11vp的病毒量稀释到100μL

1 天

大鼠尾静脉注射

感染肝脏

 

5+E9PFU

14 天

AAV

肝动脉或门静脉原位注射AAV 感染的骨髓间充质干细胞

 

2+E11 个病毒颗粒稀释于300μL 的生理盐水

28 天


肺 

病毒类型

注射部位

病毒滴度

注射方法

检测时间

慢病毒

小鼠尾静脉注射感染肺

1+E8MOL/ 小鼠

使用30 号针头,超细胰岛素注射器注射200μL,1 周2 次,注射1个月

42 天

腺病毒

恒河猴肺叶定点注射

 

100μL

4 周

AAV

经呼吸道滴鼻法

1+E11-12v.g/mL

 

1+E11-12v.g/mL

 

1 个月


  以上给大家介绍了在体实验中病毒该如何选择以及其特点和在不同系统中的注射剂量推荐,接下来给大家解惑一下病毒注射中常遇到的表达效果不好和荧光问题。

  病毒注射动物的时候
  表达不好或非常弱怎么办?

  首先需要排除病毒注射手法、实验剂量、取材时间、组织处理、切片上的问题。

  大部分情况,往往是实验的手法并不熟练,或者可能没有打准位置,特别是一些带特异启动子的 AAV,观察的时间点太早,导致目的基因还没有表达完全。建议重新摸索实验条件。

  注射病毒的对照也有荧光亮?
 
  常见于组织处理有问题,例如多聚甲醛浸泡时间过久、组织切片染色的时候太干燥,导致非特异性背景过高,在此建议重新改善组织处理的流程。

  关于工具病毒在体实验中的问题您都get了,现在您或许正需要付诸实践,但缺少病毒产品。